2.8 10批样品含量测定
分别取10批样品(批号:20160324、马香20160616、苓口立20160623、服液方法20160625、中白酯Ⅲ20160704、术内20160705、含量20160712、测定20160714、马香20160717、苓口立20160721、服液方法20160724)按供试液法每批次各平行制备2份供试液,中白酯Ⅲ按色谱条件自动进样测定,术内其对照液白术内酯Ⅲ(浓度71.76 μg/mL)分别进样30、含量20、测定10 μL,马香且每个进样量分别进样2次;每份供试液各进样2针,记录色谱图和峰面积,并计算含量以及RSD值(表7),计算得马香苓口服液中白术内酯Ⅲ不同进样量含量分别为2.15、2.58、2.54,平均含量为2.43 μg/mL,相对含量RSD=9.82%。考虑到大规模生产中的各种损失和测量误差,取其平均值的80%作为其含量限度,即2.43×0.80=1.94,故暂定马香苓口服液中白术药材按白术内酯Ⅲ计不少于1.94 μg/mL。
3 讨论
3.1 待测组分选择
白术的内酯类成分具有抗炎、增强免疫、利尿等作用,而且还可以调理胃肠道和促进营养物质的吸收,其中白术内酯Ⅰ、Ⅲ的药理作用较为明显,也是发挥白术健脾益气、燥湿利水的功效之一。在炮制过程中苍术酮被氧化,其产物是双白术内酯、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ,同时白术内酯Ⅲ在经高温加热过程中会生成白术内酯Ⅱ;从氧化反应机制来看,苍术酮易与水发生加成反应,生成半缩醛羟基,而水又导致半缩醛羟基开环生成羰基,羰基进一步被氧化生成羧基,杂化轨道平面两侧容易被羟基进攻羧基,羟基并与羧基进行分子内脱水反应,可生成白术内酯Ⅰ和表白术内酯Ⅰ,而白术内酯Ⅰ在7位上与碳相连的氢相比较为活跃,易被羟基取代而生成白术内酯Ⅲ。白术内酯Ⅲ的结构较其稳定,更有利于含量测定。
3.2 供试液前处理
按照萃取溶剂的方法,考察了正丁醇、石油醚(30℃~60℃)、石油醚(60℃~90℃)、乙酸乙酯等有机溶剂,经过与标准品色谱法相比较,石油醚(60℃~90℃)所萃取得到的供试液峰形较好,分离度高,但其前面有一小杂峰,后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作为复级溶液,考虑到白术内酯类成分的稳定性,并同时选择了考察柱温的最佳条件(20℃、30℃、35℃),结果表明,在柱温为25℃、选用500 mL/L甲醇水溶液作为复级溶液,所出的峰形分离度高,峰形对称且含量较高。有关提取次数优选,在其他相同条件下,用石油醚(60℃~90℃)振摇提取3~5次,结果表明,用供试品提取3次与4、5次有较大差异,而4、5次时白术内酯Ⅲ含量无明显差异,故选择用石油醚(60℃~90℃)振摇提取4次。
3.3 色谱条件选择
本制剂通过单因素试验,对其柱子型号、柱温、流速、流动相比例进行优化和系统适用性试验以及波长的选择,用紫外分光光度计测量白术内酯Ⅲ的最大吸收波长,结果在223 nm处吸收峰最强;在流动相选择上参考其他学者研究,用标准品白术内酯Ⅲ进行判定等度条件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情况,试验表明用甲醇-水(60∶40)对其标准品的峰更好,含量更高,同样条件下进样测定供试液,发现其分离度达不到《中国兽药典》的要求,杂峰较多,故进行了梯度洗脱,考虑中药成分复杂多样,会影响色谱柱的质量以及下一针进样的出峰情况,故在样品目标峰等完全出完过后使用了纯甲醇进行冲洗色谱柱10 min, 然后用15 min再平衡到流动相的初始比例以方便下一针进样分析,最终确定了流动相条件。在其他条件不变情况下,柱温的改变对其供试品溶液中白术内酯Ⅲ含量的相对标准偏差为4.15%,且柱温过高,易导致峰形不对称,有拖尾现象,综合考虑,最终选用柱温为25℃;在柱温25℃等其他条件不变情况下,改变流速0.8 mL/min±0.2 mL/min, 发现供试品溶液中白术内酯Ⅲ含量相对标准偏差为3.49%,说明改变流速对样品中白术内酯Ⅲ的测定无影响,对其样品出峰时间早晚有一定影响,但对峰的对称性、分离度无影响,故最终确定流速为0.8 mL/min。
试验证明以流动相甲醇-水(体积比)进行梯度洗脱(甲醇60→65、水40→35运行30 min, 甲醇65→100、水35→0运行2 min, 甲醇100、水0运行10 min, 甲醇100→60、水0→4运行3 min, 甲醇60、水40运行15 min)、检测波长223 nm、柱温25℃、流速0.8 mL/min的色谱条件对白术内酯Ⅲ的测定具有较强的专属性,能达到基线平衡、与其他组分离度较高、峰形对称、阴性对照无干扰、大大缩短分析时间,便于作为含量测定和方法学研究。
建立的HPLC方法测定白术内酯Ⅲ含量的线性关系良好,精密度、重复性、稳定性试验的平均峰面积RSD分别为2.00%、6.00%和8.58%;平均加样回收率为98.04%,RSD=11.89%,其回收率相对良好,进行10批样品的含量测定,暂定马香苓口服液中白术药材按白术内酯Ⅲ计不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征图谱专属性强、准确可行、简便,可快速用于鉴别马香苓口服液中白术内酯Ⅲ以及其含量,可有效地用于该制剂的质量控制,同时该方法还可以为进一步加强含白术类化合物的制剂质量控制提供参考,为申报新兽药质量标准提供一定的数据支撑。
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